2014, Vol. 
引用本文 | doi: 10.7501/j.issn.1674-5515.2014.10.008 |
2. 天津市汉康医药生物技术有限公司, 天津 300409
2. Tianjin Hankong Medicine & Biotechnology Company, Tianjin 300409, China
氢溴酸替格列汀是一种新型的二肽基肽酶4（DPP-4）抑制剂，通过抑制DPP-4活性而减少胰高血糖素样肽-1（GLP-1）在体内的失活，增加GLP-1在体内的水平，而GLP-1能以葡萄糖浓度相关的方式增强胰岛素分泌，并抑制胰高血糖素分泌，与同类药物相比，能够更加平稳、有效的控制血糖[1, 2]。氢溴酸替格列汀由田边三菱制药株式会社研发，2012年6月在日本获批上市销售，目前在我国仍处于研发阶段，但由于本品的治疗机制不仅具有胰岛素分泌作用，而且还具有减少低血糖发生率以及不增加体质量的优点而备受关注。在本品的合成中发现替格列汀在与氢溴酸成盐过程中（图 1），其反应通常会以低级醇为溶剂[3]，在反应过程中，氢溴酸可能会与乙醇反应产生副产物溴乙烷，而溴乙烷属于卤代烷烃，卤代烷烃通常是带有潜在危险的烷基化剂，且溴化物较氯化物烷基化能力更强。据报道溴乙烷已被美国加州列入致癌物质和生殖毒性物质，因此需高度关注。根据欧洲医药评价署（EMEA）关于《遗传毒性杂质限度指导原则》，此类物质通常需控制在1×10−6级，因此对该物质的检测难度很大。本实验建立气相色谱法测定氢溴酸替格列汀中溴乙烷的残留量，以更好地控制产品的质量。
 | 图 1 氢溴酸替格列汀的合成路线Fig. 1 Synthetic route of teneligliptin hydrobromide |
岛津GC 2010高效气相色谱仪，GC-Solution工作站，AE100万分之一天平。
溴乙烷对照品（百灵威科技有限公司，质量分数99%，产品编号502347），二甲亚砜（色谱纯，天津市风船化学试剂科技有限公司），氢溴酸替格列汀原料（天津市汉康医药生物技术有限公司，批号140601、140602、140603，质量分数均≥99%）。
2 方法与结果 2.1 色谱条件迪马DM-624色谱柱（30 m×0.53 mm×3.0 μm）；电子捕获检测器（ECD）；程序升温：初始柱温40 ℃，保持3 min，以20 ℃/min升温至200 ℃，保持5 min；进样口温度：210 ℃；检测器温度：210 ℃；载气：氮气；分流比：3∶1；进样量1 μL。
2.2 溶液的制备 2.2.1 样品溶液的配制精密称取氢溴酸替格列汀原料样品1 g，置10 mL量瓶中，加二甲基亚砜适量使溶解，并稀释至刻度，即得。
2.2.2 对照品溶液的配制取溴乙烷对照品37.5 mg，置100 mL量瓶中，加二甲亚砜溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取1 mL，置10 mL量瓶中，加二甲亚砜稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。再精密量取1 mL，置10 mL量瓶中，加二甲亚砜稀释至刻度，摇匀，即得。
2.2.3 空白溶剂的配制量取空白溶剂二甲亚砜溶液1 μL，即得。
2.3 标准曲线的绘制精密量取溴乙烷对照品储备液稀释制成0.75、2.25、3.75、5.25、6.75 μg/mL溶液，进样测定，记录色谱图。以峰面积为横坐标，质量浓度为纵坐标，进行线性回归，其回归方程为Y＝473.3 X＋285.9（r＝0.999 7）。结果表明溴乙烷在0.75～6.75 μg/mL与峰面积呈良好的线性关系。
2.4 最低检测限的测定溴乙烷对照品溶液逐步稀释进样，记录峰高为3倍噪音时，溴乙烷的最低检测限为0.26 μg/mL。
2.5 精密度试验精密量取溴乙烷对照品溶液1 μL，重复进样6次，测定峰面积值，结果其RSD值为1.1%。
2.6 回收率试验取氢溴酸替格列汀原料样品1 g，共10份，1份作为空白溶液，精密称定，分别置10 mL量瓶中，精密量取溴乙烷对照品储备溶液0.8、1.0、1.2 mL各3份，分别加入10 mL量瓶中，加二甲亚砜稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。分别量取供试品溶液、空白溶液和溴乙烷对照品溶液1 μL，分别进样，按外标法计算回收率。结果溴乙烷的平均回收率为99.4%，RSD值为0.3%（n=9）。
2.7 样品测定取氢溴酸替格列汀原料样品1 g，置10 mL量瓶中，加二甲基亚砜适量使溶解并稀释至刻度，作为供试品溶液；另取溴乙烷对照品37.5 mg，置100 mL量瓶中，加二甲亚砜溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1 mL，置10 mL量瓶中，加二甲亚砜稀释至刻度，摇匀，精密量取1 mL，置10 mL量瓶中，加二甲亚砜稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。取供试品溶液和对照溶液分别进样，按外标法以峰面积计算，结果见图 2。结果批号140601、140602、140603样品中均未检出溴乙烷。
 | 图 2 氢溴酸替格列汀（A）、溴乙烷对照品（B）和空白溶剂二甲亚砜（C）的气相色谱图Fig. 2 GC chromatograms teneligliptin hydrobromide samples (A), bromoethane reference substance (B), and blank solvent dimethyl sulfoxide (C) |
遗传毒性杂质的毒性是近年来人用药物注册技术要求国际协调会议（ICH）、EMEA以及FDA开始密切关注的问题。根据EMEA颁布的《遗传毒性杂质限度指导原则》，以毒理学担忧阈值（TTC）来确定任何未研究化合物不引起显著致癌或其他毒性作用风险的通常暴露水平，该TTC值估计为1.5 μg/(人∙d)[4]，按氢溴酸替格列汀片的日最大服用剂量计算，其中含有的溴乙烷的限度应为3.75×10−5。
本实验对氢溴酸替格列汀中遗传毒性杂质溴乙烷的检测手段进行了研究，该检测方法通过试验证明可以实现氢溴酸替格列汀中溴乙烷的准确检测，检测的灵敏度能达到2.6×10−6，且在测定的浓度范围内线性关系良好，因此本方法应用于氢溴酸替格列汀中溴乙烷的测定准确、可信，而且该方法也可应用于其他药物的溴乙烷的检测中。
| [1] | 刘永贵, 田 红, 解学星, 等. 治疗2型糖尿病的非胰岛素类药物的研究进展 [J]. 现代药物与临床, 2013, 28(2): 108-113. |
| [2] | 王小彦, 王玉丽, 徐为人. 近几年治疗糖尿病热点靶点的研究进展 [J]. 药物评价研究, 2012, 35(1): 42-45. |
| [3] | Yoshida T, Akahoshi F, Sakashita H, et al. Discovery and preclinical profile of teneligliptin (3-[(2S, 4S)-4-[4-(3- methyl-1-phenyl-1H-pyrazol-5-yl)piperazin-1-yl] pyrrolidin- 2-ylcarbonyl] thiazolidine): a highly potent, selective, long-lasting and orally active dipeptidyl peptidase IV inhibitor for the treatment of type 2 diabetes [J]. Bioorg Med Chem, 2012, 20: 5705-5719. |
| [4] | European Medicines Agency. Guideline on the limits of genotoxic impurities [S]. 2006. |