肺癌是世界范围内的一种常见的发病率非常高的恶性肿瘤，而且具有非常高的死亡率^[1]。因为没有明显的病发现象和按期的体检，大部分患者都是在晚期时才被确诊，这就导致会出现转移现象，错过了临床上手术治疗的最佳时间。在临床上治疗肺癌的手段主要包括化疗、放疗、物理治疗、分子靶向治疗等手段^[2]。茶多酚是茶叶中的有效成分，对肝癌、艾氏腹水癌等肿瘤都具有抗肿瘤效果^{[3, 4, 5, 6]}。茶多酚对肿瘤的抑制作用体现在每个阶段：诱导细胞凋亡、抑制肿瘤细胞的增殖、阻遏细胞传导通路、阻滞肿瘤细胞的细胞周期、抑制端粒酶活性、抑制血管形成等^[7]。莱菔硫烷是十字花科植物中的成分，可以抑制化学物诱发肿瘤的起始阶段，对肿瘤有抑制作用^[8]。研究表明癌症的病变过程中，蛋白激酶A锚定蛋白95、细胞周期蛋白E2起相当重要的作用^{[9, 10, 11]}。因此本实验选用莱菔硫烷联合茶多酚治疗，考察肺癌组织中蛋白激酶A锚定蛋白95、细胞周期蛋白E2的表达。

收集从2010年11月至2013年8月我院肿瘤科收治的经病理证实且经过手术的56例肺癌患者作为研究对象，其中有26例为管内型肺癌患者，结节型患者为8例，管壁浸润型患者为6例，块状型患者为12例，弥漫浸润型患者为4例，疗程为4个周期，治疗前患者均签署知情同意书，经医院医学伦理委员会批准。随机分成2组，两组患者的年龄、性别等方面经统计学分析无统计学差异。

将选取的治疗组患者给予莱菔硫烷（上海谱振生物科技有限公司）20 mg/支和茶多酚（安徽省歙县茶叶生物碱厂）依据说明书，2粒/d，2次/d，在2个周期治疗中连续服用联合治疗，对照组不使用药物治疗，给予正常的护理。

取肺癌组织，匀浆，在低温下以3 000 r/min离心15 min，取上清液置于−40 ℃保存待测。选用双抗体ELISA法测定蛋白激酶A锚定蛋白95、细胞周期蛋白E2水平，试剂盒购于美国RnD公司，实验步骤严格按照试剂盒说明书进行操作。

取所有患者的肺癌变鲜活组织，浸泡在4%甲醛中固定，石蜡包埋，石蜡切片机切片，采用链霉菌抗生素蛋白过氧化物酶测定，实验步骤按照试剂盒说明书严格执行，用已知的蛋白激酶A锚定蛋白95、细胞周期蛋白E2肺癌组织作为阳性对照，阴性对照组采用的是PBS作为一抗进行孵化，鼠抗人以及显色剂等均购自与北京中杉生物科技有限公司。微血管密度（MVD）的计数根据参考文献报道方法^[12]：首先在低倍镜下对整个切片进行分析，寻找血管最密集处，然后在高倍镜下对染色的血管进行计数。组织中蛋白激酶A锚定蛋白95、细胞周期蛋白E2的测定采用灰度值扫描，通过与β-actin进行比较得出灰度值比，组织中蛋白激酶A锚定蛋白95、细胞周期蛋白E2的表达采用吸光度值计算质量浓度表示。

取患者术后肺癌组织，液氮研磨使细胞破裂充分，将已经破碎的组织装入混匀器中进行混匀，然后按照100 μL/10 ng加入含PMSF的裂解液，载冰块上孵育30 min，然后低温以12 000 r/min离心5 min，取上清，−80℃冻存备用。组织总蛋白经考马斯亮蓝进行定量。组织样品加入0.25倍量5×SDS上样缓冲液进行混匀，6 min左右煮沸变性，用10% SDS-PAGE 115 V电泳，210 mA恒流1 h，40 min湿转至硝酸纤维膜上。用5%的脱脂奶粉TBST缓冲液室温封闭3 h，加抗蛋白激酶A锚定蛋白95受体（AKAP-8）、细胞周期蛋白E2受体单抗（鼠抗人，1∶500）。用TBST洗膜3次，每次10 min，结合辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG（1∶5 000）室温孵育1 h，TBS洗膜3次，每次10 min，最后采用发光试剂盒ECL反应，X胶片曝光显影。

采用SPSS 17.0统计软件包以及Image J4.2对数据、图片进行处理，对计量资料采用t检验，以进行计数，计数资料采用χ²检验。

蛋白激酶A锚定蛋白95和细胞周期蛋白E2的浓度水平在治疗组和对照组中比较，均具有统计学意义（P＜0.05），提示治疗组对肿瘤具有一定的抑制作用。见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 各组组织中蛋白激酶A锚定蛋白95、细胞周期蛋白E2表达水平（x ± s，n=28） Table 1 Expression levels of protein kinase A anchored protein 95 and cyclin E2 in tissues in each group 组别 锚定蛋白95浓度 水平/(pg·mL−1) 细胞周期蛋白E2浓度 水平/(pg·mL−1) 治疗 33.47±5.43 1.09±0.32 对照 73.67±6.74 2.94±0.61 与对照组比较：*P＜0.05 *P<0.05vs control group

表 1 各组组织中蛋白激酶A锚定蛋白95、细胞周期蛋白E2表达水平（x ± s，n=28） Table 1 Expression levels of protein kinase A anchored protein 95 and cyclin E2 in tissues in each group

肺癌患者病变组织中蛋白激酶A锚定蛋白95表达明显高于治疗组，两者差异具有显著性（P＜0.05）；细胞周期蛋白E2蛋白在肺癌患者病变组织中表达也明显高于治疗组，差异具有显著性（P＜0.05）。研究中发现无论是治疗组还是对照组中两种蛋白均具有表达，但是对照组中表达量明显高于治疗组。在进行MVD计数中，对照组肺癌患者病变组织中以蛋白激酶A锚定蛋白95标记的MVD高于治疗组，对照组肺癌患者在病变组织中以细胞周期蛋白E2标记的MVD高于治疗组（P＜0.05）。见表 2。

表 2(Table 2)

表 2 各组组织中蛋白激酶A锚定蛋白95、细胞周期蛋白E2表达与血管的关系的比较（x ± s，n=28） Table 2 Comparison on relationships between expression of protein kinase A anchored protein 95 and cyclin E2 with vascular (x ± s, n=28) 组别 白激酶A锚定蛋白95 细胞周期蛋白E2 阳性表达率 MVD 阳性表达率 MVD 治疗 24.2% 4.03±0.75 22.7% 3.53±1.12 对照 67.0% 9.14±1.12 56.5% 9.01±1.13 与对照组比较：*P＜0.05 *P<0.05 vs control group

表 2 各组组织中蛋白激酶A锚定蛋白95、细胞周期蛋白E2表达与血管的关系的比较（x ± s，n=28） Table 2 Comparison on relationships between expression of protein kinase A anchored protein 95 and cyclin E2 with vascular (x ± s, n=28)

治疗组蛋白激酶A锚定蛋白95、细胞周期蛋白E2蛋白表达较少，而对照组蛋白激酶A锚定蛋白95、细胞周期蛋白E2的蛋白表达量明显高于治疗组，相对于给药组差异具有显著性（P＜0.05），提示治疗组具有一定的抑制肿瘤的效果。见表 3。

表 3(Table 3)

表 3 蛋白激酶A锚定蛋白95、细胞周期蛋白E2的蛋白表达情况（x ± s） Table 3 Expression of protein kinase A anchored protein 95 and cyclin E2 (x ± s) 组别 蛋白表达 锚定蛋白95 细胞周期蛋白E2 治疗 0.123±0.001 0.192±0.011 对照 0.387±0.027 0.602±0.103 与对照组比较：*P＜0.05 *P<0.05vs control group

表 3 蛋白激酶A锚定蛋白95、细胞周期蛋白E2的蛋白表达情况（x ± s） Table 3 Expression of protein kinase A anchored protein 95 and cyclin E2 (x ± s)

以蛋白激酶A锚定蛋白95、细胞周期蛋白E2为考察指标评价茶多酚联合莱菔硫烷对肺癌患者的治疗作用。将实验分为治疗组和对照组，采用Western bloting检测来分析不同组别中蛋白激酶A锚定蛋白95、细胞周期蛋白E2的含量。结果显示，治疗组蛋白激酶A锚定蛋白95、细胞周期蛋白E2蛋白表达较少，而对照组蛋白激酶A锚定蛋白95、细胞周期蛋白E2的蛋白表达量明显高于给药组，相对于给药组差异具有显著性（P＜0.05），给药组具有一定的抑制肿瘤的效果。通过应用ELISA检测组织中蛋白激酶A锚定蛋白95、细胞周期蛋白E2含量，结果显示蛋白激酶A锚定蛋白95的表达在治疗组和 对照组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）。细胞周期蛋白E2在治疗组和对照组中相较，差异具有统计学意义（P＜0.05）。结果显示茶多酚联合莱菔硫烷可以有效的抑制肿瘤的生长，对肺癌具有一定的抑制作用。应用免疫组织化学测定MVD对肿瘤组织部位的血管进行计算，治疗组的血管含量低于对照组，说明肿瘤组织生长受到了抑制，有抗肿瘤的效果。以上实验证明茶多酚联合莱菔硫烷对对肿瘤组织的生长具有抑制作用，治疗组的蛋白激酶A锚定蛋白95、细胞周期蛋白E2的表达低于对照组，说明蛋白激酶A锚定蛋白95、细胞周期蛋白E2的表达与肿瘤的生长呈正相关性。

周期蛋白E2是细胞核内蛋白，位置在8号染色体q22.1上。蛋白上具有1个2 801 bp的 cDNA片段，它编码1个含有404个氨基酸残基的开放阅读的框架，大小为2.8 kb mRNA，相对分子质量是4.7×10⁷。47%的同源性是这个编码蛋白和周期蛋白E1所具有的，拥有1个周期蛋白盒基序^[13]。这个基序是所有的细胞周期蛋白所共拥有的。蛋白激酶A锚定蛋白95刚开始被认为是一种蛋白激酶A锚定蛋白，它能够将蛋白激酶A特异地锚定于细胞核内的作用^[14]。最近发现蛋白激酶A锚定蛋白95不仅仅是一种蛋白，它还参与细胞内许多生命过程，如参与了细胞分裂染色体集缩的建立以及集缩状态的保持^[15]。还参与了DNA的复制维持信使RNA的稳定以及基因表达，参与细胞凋亡以及参与细胞周期调控^{[16, 17]}。

茶多酚和莱菔硫烷都是治疗肿瘤的临床药物，实验中没有考察两种药物单独使用对肿瘤的抑制作用，二者结合可以对肿瘤起到抑制作用，蛋白激酶A锚定蛋白95、细胞周期蛋白E2是人体细胞的重要组成蛋白，二者的表达增多与肿瘤的生长有明显的相关作用。本实验考察茶多酚和莱菔硫烷联合用药对肿瘤组织中两种蛋白表达的影响。结果证明，联合用药抗肿瘤可以对肿瘤组织起到抑制作用，两种蛋白的表达明显下降。说明两种蛋白的表达与肿瘤的生长呈正相关性。而联合用药对两种蛋白可以起到抑制作用。