中草药  2016, Vol. 47 Issue (2): 194-199
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引用本文doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.02.002
谢美萍, 李兰, 鲁安琪, 郑远鹏, 臧彩霞, 孙华, 王素娟. 狗脊中的酚酸及其苷类成分[J]. 中草药, 2016, 47(2): 194-199.
XIE Mei-ping, LI Lan, LU An-qi, ZHENG Yuan-peng, ZANG Cai-xia, SUN Hua, WANG Su-juan. Phenolic acid and glycosides from rhizomes of Cibotium barometz[J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs, 2016, 47(2): 194-199.
狗脊中的酚酸及其苷类成分
谢美萍, 李兰, 鲁安琪, 郑远鹏, 臧彩霞, 孙华, 王素娟     
中国医学科学院 北京协和医学院药物研究所 天然药物活性物质与功能国家重点实验室, 北京 100050
收稿日期: 2015-09-29;
基金项目: 国家重大专项重大新药创制课题(2012ZX09301002001003)
作者简介: 谢美萍(1990-),女,硕士在读,研究方向为天然药物的活性成分。Tel: 15510728258 E-mail: mpxie@imm.ac.cn
通讯作者: 王素娟,女,副研究员,硕士生导师,主要从事天然药物活性成分研究。Tel: (010)60212110 E-mail: sujuanwang@imm.ac.cn
摘要: 目的 研究狗脊Cibotium barometz根茎的化学成分。方法 采用大孔吸附树脂、柱色谱及制备HPLC进行分离纯化,并采用波谱学分析和化学方法鉴定其结构,筛选其抗炎(LPS诱导小鼠腹腔BAW细胞分泌NO模型)、神经保护(谷氨酸诱导SK-N-SH细胞损伤模型)、肝保护(APAP诱导HepG2细胞损伤模型)、肿瘤细胞毒(MTT法)、抗糖尿病(α糖苷酶和PTP1B酶抑制模型)和雌激素受体拮抗剂/激动剂等生物活性。结果 从狗脊根茎50%乙醇提取物中分离得到了9个酚酸及其苷类化合物,分别鉴定为原儿茶酸-4-O-(6'-O-原儿茶酰基)-β-D-吡喃葡萄糖苷(1)、白藜芦醇(2)、对羟基肉桂酸(3)、对羟基肉桂醛(4)、C-藜芦酰乙二醇(5)、4-甲基邻苯二酚(6)、原儿茶醛(7)、对羟基苯甲酸(8)、咖啡酸(9)。在浓度10、1及0.1 μmol/L下化合物1对BAW细胞释放NO的抑制率分别为75.3%、72.0%和58.0%,在浓度10 μmol/L下化合物1对APAP引起的HepG2细胞损伤具显著保护作用,细胞存活率与阳性对照双环醇相当,在肿瘤细胞毒、雌激素受体激动剂和拮抗剂筛选模型下均未显示出显著的药理活性。在浓度1 μmol/L下化合物2对BAW细胞释放NO的抑制率为50.0%,其他药理模型下均未显示出显著的药理活性。结论 化合物1为新化合物,命名为双原儿茶酸苷;且具有较好的抗炎、肝保护活性,化合物2～5均为首次从该属植物中分离得到。
关键词: 狗脊     酚酸类     原儿茶酸-4-O-(6'-O-原儿茶酰基)-β-D-吡喃葡萄糖苷     双原儿茶酸苷     抗炎     保肝作用    
Phenolic acid and glycosides from rhizomes of Cibotium barometz
XIE Mei-ping, LI Lan, LU An-qi, ZHENG Yuan-peng, ZANG Cai-xia, SUN Hua, WANG Su-juan    
State Key Laboratory of Active Substance and Function of Natural Medicines, Institute of Materia Medica, Chinese Academy ofMedical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China
Abstract: Objective To investigate the chemical constituents from the rhizomes of Cibotium barometz. Methods Macroporous adsorption resin, column chromatography, and preparative HPLC were carried out to isolate and purify the chemical compounds in the 50% ethanol extracts from the rhizomes of C. barometz, and their structures were elucidated by spectroscopic and chemical analyses. The activities of compounds 1 and 2 were tested on in vitro assays of anti-inflammatory, anti-tumor, neuro-protection, anti-diabetes, estrogen receptor agonism, and estrogen receptor antagonism. Results Nine compounds were isolated and identified as protocatechuic acid-4-O-(6'-O-protocatechuoyl)-β-D-pyranoglucoside (1), resveratrol (2), p-hydroxycinnamic acid (3), p-hydroxycinnamic aldehyde (4), C-veratroylglycol (5), 4-methyl-1,2-dihydroxybenzene (6), protocatechualdehyde (7), p-hydroxybenzoic acid (8), and caffeic acid (9). Compound 1 showed anti-inflammatory activity at the concentration of 10, 1, and 0.1 μmol/L with inhibition rates of 75.3%, 72.0%, and 58.0% to NO release of BAW cells, respectively, and exhibited promising hepatoprotective activity against APAP-induced acute liver damage of HepG 2 cells in vitro as effective as bicyclol. Compound 2 showed anti-inflammatory activity at the concentration of 1 μmol/L with inhabition rate of 50.0%. There were no activity on other assays, such as anti-tumor, estrogen receptor agonism, and estrogen receptor antagonism. Conclusion Compound 1 is a new compound named biprotocatechuicoside with promising anti-inflammatory and hepatoprotective activity, and compounds 2-5 are isolated from the plants of Cibotium Kaulf. for the first time.
Key words: Cibotium barometz (L.) J. Sm.     phenolic acids     protocatechuic acid-4-O-(6'-O-protocatechuoyl)-β-D-pyranoglucoside     biprotocatechuicoside     anti-inflammation     hepatoprotection    

狗脊始载于《神农本草经》，列为中品，为蚌壳蕨科（Dicksoniaceae）植物金毛狗脊Cibotium barometz (L.) J. Sm. 的干燥根茎，历版《中国药典》均有收载。金毛狗脊根茎较硬，外被很多金色绒毛，因此被称为“金毛狗脊”或者“黄狗头”[1]。蚌壳蕨科植物共5属，近40种，分布于热带及亚热带。其中金毛狗属植物约20种，分布于东南亚至大洋洲、夏威夷及中部美洲。我国蚌壳蕨科植物仅有1属1种，即金毛狗脊Cibotium barometz(L.) J. Sm.，主要产于云南、贵州、四川南部、广西、广东、福建、台湾、海南、浙江、江西和湖南等地的山脚阴湿缓坡或沟谷密林下的酸性土壤[2]。

狗脊具有补肝肾、强筋骨、舒经络、除湿痛及利尿的功能，用于腰腿酸痛、手足麻木、半身不遂、白带遗精、血崩等症[3]。研究发现，金毛狗脊中含蕨素类[4, 5, 6, 7, 8, 9]、萜类[7]、甾体[6, 7, 10]、黄酮类[4, 5]、糖苷类[11, 12]、芳香族[4, 5, 6, 7, 8, 9]、吡喃酮类[9]等化学成分。狗脊中的特征性成分主要包括蕨素类成分和半萜糖苷类成分，但自20世纪80年代发现狗脊中存在蕨素类成分以来，其化学成分的研究进展甚慢，目前发现的这两类特征性成分不超过20个。因此，本实验对狗脊的化学成分进行了深入研究，从其根茎部位分离得到9个酚酸及其苷类化合物，分别鉴定为原儿茶酸-4-O- (6′-O-原儿茶酰基)-β-D-吡喃葡萄糖苷[protocatechuic acid-4-O-(6′-O-protocatechuoyl)-β-D-pyranoglucoside，1]、白藜芦醇（resveratrol，2）、对羟基肉桂酸（p-hydroxycinnamic acid，3）、对羟基肉桂醛（p-hydroxycinnamic aldehyde，4）、C-藜芦酰乙二醇（C-veratroylglycol，5）、4-甲基邻苯二酚（4-methyl- 1,2-dihydroxybenzene，6）、原儿茶醛（protocatechualdehyde，7）、对羟基苯甲酸（p- hydroxybenzoic acid，8）、咖啡酸（caffeic acid，9）。其中化合物1为新化合物，命名为双原儿茶酸苷，具有较好的抗炎和保肝活性，化合物2～5均为首次从该属植物中分离得到。

1 仪器与试剂

Agilent 1100高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；AV-III-500型核磁共振仪（德国Bruker公司）；Inova-500型核磁共振仪、Inova-600型核磁共振光谱仪（美国Varian公司）；1100 Series LC-MSD Trap SL质谱仪（美国Agilent公司）；API-TOFMS 10000质谱仪（禾信质谱公司）；柱色谱硅胶（100～200、200～300目，青岛海洋化工厂）；Sephadex LH-20凝胶（美国GE公司）；中压液相色谱仪：Büchi Gradient Former B-687，RP C18，43～60 μm（Pharmacia公司）；RP C18（10 μm，制备型；5 μm，半制备型和分析型）；薄层色谱硅胶GF254（青岛海洋化工厂）。MCI CHP20P（日本三菱公司）。

狗脊药材购于河北安国药材市场，产于广西凭祥，由中国医学科学院药物研究所马林副研究员鉴定为金毛狗脊Cibotium barometz (L.) J. Sm. 的干燥根茎，标本（ID-S-2606）保存于中国医学科学院药物研究所标本室。

2 提取与分离

金毛狗脊根茎60 kg，粉碎，用50%乙醇回流提取3次（240 L×2 h、180 L×1.5 h、180 L×1.5 h），除药渣浓缩，用水溶解至约60 L（即2个柱体积），经SP-700大孔吸附树脂，分别用水及30%、50%、100%乙醇分段洗脱，回收溶剂，得到相应的部分。将其50%乙醇部分（1 098 g）经MCI CHP20P柱色谱，以水及10%、20%、30%、40%、50%、82% 甲醇梯度洗脱，得到7个组分。其中10%甲醇洗脱组分（120 g）经Sephadex LH-20柱色谱，以水及50%、100%甲醇洗脱，得到3个组分（A、B、C）。组分A经硅胶柱色谱及HPLC制备，得化合物5（3 mg）、6（200 mg）、7（3 mg）、8（10 mg）、9（50 mg）。组分B经中压反相ODS柱色谱，以0～70%甲醇洗脱得化合物1（30 mg）、2（5 mg）、4（5 mg）。组分C经硅胶柱色谱及HPLC制备，得化合物3（800 mg）。

3 糖绝对构型的确定

取化合物1（0.5mg）溶于0.5 mol/L HCl（0.1 mL）中90 ℃反应2 h，加入氨水至中性，用醋酸乙酯萃取3次（0.2 mL/次），水相冻干。冻干后的样品及约0.5 mg的D/L-葡萄糖对照品，分别加入含有0.5 mg L-半胱氨酸甲酯盐酸盐的吡啶溶液0.1 mL，60 ℃反应1 h；然后加入含有0.5 mg邻甲苯异硫氰酸酯的吡啶溶液0.1 mL，60 ℃反应1 h。反应液滤过，取适量注入HPLC分析。色谱柱为GraceSmart RP18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈-50 mmol/L磷酸水溶液25∶75，体积流量0.8 mL/min，波长250 nm。待测样品与D/L-葡萄糖对照品衍生化物对照，检出D-葡萄糖。

4 结构鉴定

化合物1：白色针晶（甲醇）。[α]25D −40.1° (c0.1, MeOH)；mp 137.1～138.3℃。ESI-MS m/z: 475 [M＋Na]+, 451 [M－H]−，(−)HR-API-MS给出准分子离子峰451.087 4 [M－H]−(C20H19O12−，计算值451.088 2)，确定分子式为C20H20O12，不饱和度为10。UV（MeOH）光谱在λmax 260.2 nm (ε 7.6×104)，293.8nm (ε 7.7×104) 给出最大吸收带，说明化合物分子结构存在长共轭系统。红外光谱中1 607.2, 1 509.2和1 446.9 cm−1说明含有苯环，1 693.9 cm−1说明含有羰基。

1H-NMR (500 MHz, CD3OD) 显示1个β构型糖的端基质子信号δH4.85 (1H, d, J = 7.4 Hz)。氢谱低场区的δH7.40 (1H, d, J = 2.0 Hz), 7.39 (1H, dd, J = 8.0, 2.0 Hz), 6.79(1H, d, J = 8.0 Hz) 及δH7.40 (1H, d, J = 2.0 Hz), 7.32 (1H, dd, J = 8.0, 2.0 Hz), 7.10 (1H,d, J = 8.0 Hz)，形成2个AMX芳香耦合系统，提示该化合物结构中有2个1,2,4-三取代苯环。13C-NMR (150 MHz, CD3OD) 中给出19个碳信号，低场区存在12个芳香碳信号及1个酯羰基δC 168.5，结合该化合物的苯环取代方式，提示该化合物含1个原儿茶酸酯基及另1个1,2,4-三取代苯环。通过HSQC谱指认了所有与氢相连的碳信号。在HMBC谱中（图 1），观察到葡萄糖的6位质子δH 4.62 (1H, dd, J = 12.0, 2.0Hz), 4.31 (1H, dd, J = 12.0, 8.0 Hz) 与原儿茶酸酯基碳δC 168.5相关，推定原儿茶酸酯基连接在葡萄糖的6位。糖的端基δH4.85 (1H, d, J = 7.4 Hz)，与另一组AMX系统中的4位碳信号δC 150.4相关，推定该AMX结构中的4位OH被糖苷化。在 (−) ESI-MS2中，准分子离子峰m/z 451 [M－H]−的二级质谱（图 2），出现丢失中性碎片CO2（44）的离子m/z 407，说明该化合物末端含有1个羧基，m/z 297的碎片离子说明结构中确实存在2个原儿茶酸片段，因此推断该化合物中未知的AMX结构为原儿茶酸。葡萄糖的绝对构型由HPLC柱前衍生化法[13]确定。综上分析，化合物1的结构确定为原儿茶酸-4-O-(6′-O-原儿茶酰基)-β-D-吡喃葡萄糖苷，为新化合物。具体核磁数据见表 1。

图 1 化合物1的结构和重要HMBC相关 (H→C)Fig.1 Structure and key HMBC correlations (H→C) of compound 1

图 2 化合物1 (−) ESI-MS2中准分子离子m/z 451的二级质谱裂解图Fig.2 (−) ESI-MS2 fragment of quasi-molecular ion m/z 451in compound 1

表 1 化合物1的氢谱和碳谱数据 Table 1 1H-NMR and 13C-NMR data of compound 1

化合物2：棕色粉末（甲醇）。(+) ESI-MS m/z: 7.29 (2H, d, J = 8.0 Hz, H-2′, 6′),6.70 (2H, d, J = 8.0 Hz, H-3′, 5′), 6.90 (1H, d, J = 16.0 Hz,H-β), 6.74 (1H, d, J = 16.0 Hz, H-α), 6.38 (2H, d, J = 2.0 Hz,H-2, 6), 6.10 (1H, J = 2.0 Hz, H-4)；13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ:160.0 (C-3, 5), 158.7 (C-4′), 141.6 (C-1), 130.7 (C-1′), 129.7 (C-β), 129.1(C-2′, 6′), 127.1 (C-α), 116.8 (C-3′, 5′), 106.1 (C-2, 6), 103.0 (C-4)。以上数据与文献报道基本一致[14]，故鉴定化合物2为白藜芦醇。

化合物3：白色针晶（甲醇）。(+) ESI-MS m/z: 187.4 [M＋Na]+。1H-NMR (500 MHz,CD3OD) δ: 7.53 (1H, d, J = 16.0 Hz, H-7), 6.30 (1H, d,J = 16.0 Hz, H-8), 7.38 (2H, d, J = 8.0 Hz, H-2, 6), 6.43 (2H, d,J = 8.0 Hz, H-3, 5)。以上数据与文献报道基本一致[15]，故鉴定化合物3为对羟基肉桂酸。

化合物4：白色针晶（甲醇）。(−) ESI-MS m/z: 147.0 [M－H]−。1H-NMR (500 MHz,CD3OD) δ: 9.67 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-9), 7.40 (1H, d, J= 16.0 Hz, H-7), 6.25 (1H, dd, J = 16.0, 8.0 Hz, H-8), 7.33 (2H, d, J= 8.0 Hz, H-2, 6), 6.72 (2H, d, J = 8.0 Hz, H-3, 5)。以上数据与文献报道基本一致[16]，故鉴定化合物4为对羟基肉桂醛。

化合物5：白色针晶（甲醇）。(+) ESI-MS m/z:235 [M＋Na]+。1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ: 7.54 (1H, dd, J =8.0, 2.0 Hz, H-6′), 7.52 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-2′), 6.82 (1H, d, J= 8.0 Hz, H-5′), 5.06 (1H, dd, J =5.0, 3.9 Hz, H-2), 3.86 (3H, s, -OCH3), 3.83 (1H, dd, J= 11.7, 3.7 Hz, H-3b), 3.68 (1H, dd, J = 11.5, 5.2 Hz, H-3a)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD) δ: 202.1(C-1), 156.5 (C-4′), 151.8(C-3′), 130.5 (C-1′), 127.7 (C-6′), 118.5 (C-5′), 115.0 (C-2′), 78.0 (C-2), 68.8(C-3), 59.0 (OCH3)。上述数据与文献报道基本一致[17]，故鉴定化合物5为C-藜芦酰乙二醇。

化合物6：白色针晶（甲醇）。(+) ESI-MS m/z: 147.0 [M＋Na]+。1H-NMR (500MHz, CD3OD) δ: 7.68 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-6), 6.90 (1H,s, H-2), 6.69 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-5), 1.80 (3H, s, H-7)。上述数据与文献报道基本一致[18]，故鉴定化合物6为4-甲基邻苯二酚。

化合物7：无色针晶（甲醇）。(−) ESI-MS m/z: 136.8 [M－H]−。1H-NMR (500 MHz,CD3COCD3) δ: 9.79 (1H, s, CHO), 8.67 (2H, brs, 2×OH), 7.35 (1H, dd, J= 8.0, 2.0 Hz, H-6), 7.33 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-2), 7.01 (1H, d, J= 8.0 Hz, H-5)。上述数据与文献报道基本一致[19]，故鉴定化合物7为原儿茶醛。

化合物8：米白色针晶（甲醇）。(−) ESI-MS m/z: 137.1 [M－H]−。1H-NMR (500 MHz,CD3OD) δ: 7.82 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-2, 6), 6.75 (2H, d,J = 8.5 Hz, H-3, 5)。上述数据与文献报道基本一致[20]，故鉴定化合物8为对羟基苯甲酸。

化合物9：黄色针晶（甲醇）。(−) ESI-MS m/z: 178.8 [M－H]−。1H-NMR (500MHz, CD3OD) δ: 7.47 (1H, d, J = 15.5 Hz, H-7), 6.15 (1H,d, J = 15.5 Hz, H-8), 6.97 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-2), 6.87 (1H, dd,J = 8.0, 2.0 Hz, H-6), 6.72 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-5)。上述数据与文献报道基本一致[21]，故鉴定化合物9为咖啡酸。

5 药理活性研究

化合物1表现出较强的抑制BAW细胞释放炎症因子[22]（NO）活性，在浓度10、1及0.1 μmol/L下的抑制率分别为75.3%、72.0%和58.0%；在10 μmol/L浓度下作用HepG2细胞48 h，对细胞无明显毒性，对扑热息痛（APAP）引起的HepG2细胞损伤[23]具显著保护作用，损伤组细胞存活率29.2%时，化合物1的细胞存活率为35.9%，与阳性对照双环醇（35.1%）作用相当。在肿瘤细胞毒实验[24]（MTT法：HCT-116、HepG2、BGC-823、NCI-H1650、A2780）及雌激素α受体激动剂和拮抗剂筛选模型中，均未显示出显著的药理活性。

对化合物2进行了抗炎[22]、神经保护（谷氨酸诱导神经母细胞瘤SK-N-SH细胞损伤模型）、肝保护（APAP诱导HepG2细胞损伤模型）、肿瘤细胞毒[24]、抗糖尿病（α-葡萄糖苷酶抑制模型，PTP1B酶抑制模型）[25]药理活性筛选。结果表明，化合物2在浓度1 μmol/L下表现出一定的抑制BAW细胞释放NO活性，其抑制率为50.0%，其他药理模型下均未显示出显著的药理活性。

6 结果与讨论

在化合物1的13C-NMR（CD3OD）中，末端羧基碳信号未检出，更换测定溶剂为DMSO-d6后，在1H-NMR中，低场区出现4个活泼氢的信号δH12.58, 9.85, 9.42, 9.02，即1个羧基信号及3个酚羟基信号，证实化合物1结构中确实存在游离羧基。在13C-NMR（DMSO-d6）中增加样品量后，该羧基碳即可被检测出（数据见表 1）。

化合物1中含有2个原儿茶酸的结构片段，文献报道原儿茶酸[22]对LPS诱导的BAW细胞也有明显的抗炎活性，此外，原儿茶酸还具有抑制叔丁基过氧化氢（t-BHP）[26]及脂多糖（LPS）[27]致小鼠肝损伤的作用，推测化合物1的抗炎及肝保护活性可能与结构中的原儿茶酸片段相关。化合物1结构中的原儿茶酸片段的数量与活性间的关系有待于进一步研究。

志谢：本研究所陈晓光研究员课题组测定细胞毒活性，张丹研究员课题组测定抗炎活性及肝保护活性，王晓良研究员课题组测定神经保护活性，叶菲研究员课题组测定抗糖尿病活性及国家新药筛选中心测定雌激素α受体激动剂/拮抗剂活性。

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