摘要:
目的 基于网络药理学和细胞实验验证探讨地肤子皂苷Ic治疗类风湿性关节炎的作用机制。方法 使用药物靶点数据库以及疾病靶点数据库筛选出地肤子皂苷Ic和类风湿性关节炎的作用靶点,并利用GSE55235数据集筛选出类风湿性关节炎的差异表达靶点。利用韦恩交集获得共同靶点,同时使用Cytoscape构建“药物–靶点–疾病”网络图,对交集靶点进行基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)分析,并将交集靶点导入STRING数据库,以进行蛋白质相互作用(PPI)网络的分析,使用Cytoscape中的CytoNCA插件进行拓扑分析筛选核心靶点,运用AutoDock vina、PyMOL等软件对地肤子皂苷Ic和核心靶点进行对接验证。通过CCK-8法检测地肤子皂苷Ic对RA-FLS细胞的增殖影响;流式染色法检测地肤子皂苷Ic对RA-FLS细胞凋亡的影响;ELISA实验检测检测地肤子皂苷Ic对细胞炎症因子的影响;qRT-PCR实验检测核心靶点的mRNA表达变化;Western blotting实验检测白细胞(IL)-17/核因子(NF-κB)-κB通路上蛋白的表达。结果 通过网络药理学筛出45个地肤子皂苷Ic治疗类风湿性关节炎潜在靶点,KEGG通路富集分析表明IL-17/NF-κB为核心信号通路,PPI网络拓扑分析筛选出蛋白酪氨酸磷酸酶受体C(PTPRC)、脾酪氨酸激酶(SYK)、过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPARG)、表皮生长因子受体(EGFR)、基质金属蛋白酶-9(MMP9)和趋化因子配体5(CCL5)6个核心靶点。分子对接显示地肤子皂苷Ic和6个核心靶点均具有显著的结合性。细胞实验结果表明,地肤子皂苷Ic处理24、48 h后,RA-FLS细胞的活力明显下降(P<0.01、0.001);与对照组相比,地肤子皂苷Ic 20、40、60 µmol/L组RA-FLS细胞的凋亡率显著升高(P<0.001)。与对照组相比,地肤子皂苷Ic各浓度组肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量显著降低(P<0.05、0.01、0.001);地肤子皂苷Ic 40、60 µmol/L组IL-1β、IL-17含量显著降低(P<0.05、0.01、0.001);地肤子皂苷Ic 60 µmol/L组IL-6含量显著降低(P<0.01)。与对照组相比,地肤子皂苷Ic各浓度组PPARG mRNA表达显著升高(P<0.05);地肤子皂苷Ic 60 µmol/L组PTPRC、SYK、MMP9、CCL5 mRNA表达显著下调(P<0.05、0.01);地肤子皂苷Ic 40、60µmol/L组EGFR mRNA表达显著下调(P<0.05)。与对照组相比,地肤子皂苷Ic各浓度组细胞中Act1、HSP90AA1、TRAF6蛋白相对表达量显著降低;地肤子皂苷Ic 40、60 µmol/L组IL-17A、p-p65/p65蛋白相对表达量显著降低(P<0.01、0.001)。结论 通过网络药理学以及细胞实验提示地肤子皂苷Ic可能通过调控IL-17/NF-κB信号通路发挥治疗类风湿性关节炎的作用。