摘要:
目的 探讨隐丹参酮通过靶向LASP1调控Janus激酶-信号转导及转录激活因子(JAK/STAT)信号通路对胆管癌细胞恶性进展的抑制作用及其分子机制。方法 以人胆管癌HCCC-9810、RBE细胞及正常人肝内胆管上皮细胞HIBEpic为研究对象。采用细胞计数试剂盒-8法检测隐丹参酮对细胞活力的影响并计算半数抑制浓度(IC50);通过平板克隆形成实验评估细胞增殖能力;Transwell实验检测细胞迁移与侵袭;采用流式细胞术结合碘化丙啶(PI)染色分析细胞周期分布;膜联蛋白Ⅴ(Annexin Ⅴ)-异硫氰酸荧光素(FITC)/PI双染法及Hoechst 33342染色检测细胞凋亡;使用siRNA转染技术沉默LASP1表达,并通过RT-qPCR和Western blotting分别检测LASP1的mRNA及蛋白表达水平。运用Western blotting检测细胞周期蛋白B1(Cyclin B1)、细胞周期蛋白依赖性激酶1(CDK1)、剪切型半胱氨酸蛋白酶-3(cleaved Caspase-3)、cleaved Caspase-9、B细胞淋巴瘤-2蛋白(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)以及JAK/STAT信号通路关键蛋白Janus激酶2(JAK2)、磷酸化JAK2(p-JAK2)、信号转导与转录激活因子3(STAT3)、磷酸化STAT3(p-STAT3)的表达;利用JAK2激活剂broussonin E(BE)进行回复实验验证通路作用。结果 在生物学功能方面,隐丹参酮以时间和剂量相关性方式降低了细胞活力(HCCC-9810和RBE细胞的IC50值分别为16.88、19.73μmol/L),并有效抑制了细胞的克隆形成、迁移和侵袭能力(P<0.05、0.01);细胞周期分析结果显示,隐丹参酮可将胆管癌细胞周期阻滞于G2/M期,并下调G2/M期检查点蛋白CDK1和Cyclin B1的表达(P<0.01);凋亡分析结果显示,隐丹参酮能诱导细胞凋亡,表现为凋亡形态学改变、凋亡率升高,并上调cleaved Caspase-3/9和Bax表达,下调Bcl-2表达(P<0.05、0.01);在机制层面,隐丹参酮能够抑制JAK/STAT信号通路的激活,表现为p-JAK2和p-STAT3蛋白水平降低而不影响其总蛋白表达,且此效应可被JAK2激活剂BE部分逆转(P<0.05)。分子机制探索发现,LASP1在胆管癌细胞中呈低表达状态,而隐丹参酮可显著上调其表达(P<0.01);功能回复实验表明,沉默LASP1可部分拮抗隐丹参酮对细胞增殖的抑制和凋亡的诱导作用(P<0.01)。结论 隐丹参酮可能通过上调LASP1表达,进而抑制JAK/STAT信号通路的激活,从而诱导胆管癌细胞发生周期阻滞和凋亡,最终发挥其其增殖、迁移和侵袭的抗肿瘤作用。