2017, Vol. 48
引用本文 | doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2017.01.013 |
葛根素为从豆科植物野葛Pueraria lobata (Willd.) Ohwi的干燥根中提取、分离得到的8-β-D-葡萄吡喃糖-4, 7-二羟基异黄酮，具有降低血压、改善微循环、保护心肌细胞、降低血液黏度等药理作用[1-5]。由于葛根素水溶性和脂溶性均较差[6]，在水中的溶解度仅为4.62 mg/mL，口服给药难吸收，据报道生物利用度仅有3.799%[7]。葛根素注射剂收载于《中国药典》2015年版[8]，是明确用于扩张血管的中药制剂。由于葛根素对心脑血管疾病具有广泛的药理作用，葛根素注射剂临床使用的范围有限、给药操作不便以及安全性欠佳，因而开发葛根素的新剂型具有重要意义[6, 9]。
经皮给药系统（trandermal drug delivery system，TDDS）是指药物经由皮肤给药途径转运至局部组织或全身血液循环，能够产生局部或全身治疗作用的给药方式[10]。TDDS与其他给药系统相比，具有独特的优势：可避免传统口服制剂的肝脏首关效应，维持平稳的血药浓度；与注射剂相比给药方便，提高治疗指数和患者的依从性[11]。
但皮肤致密的角质层阻碍了药物的渗透，为了解决这一难题，各种促透方法不断涌现，其中微针是一种非常高效的物理促透新技术，用于打破皮肤角质层屏障，具有给药效率高、疼痛感低、使用者顺应性强等优点[12-15]。微乳系指由油相、水相、表面活性剂及助表面活性剂组成的一种外观澄明、热力学稳定的体系[16-17]，对水溶性和脂溶性药物都具有良好的增溶能力[17-18]。微乳粒径在10~100 nm[19]，体系分布均匀，作为难溶性药物的载体应用于经皮给药具有高载药量、高渗透性的优点[20-21]。
本研究制备葛根素微乳，采用微针预先处理皮肤，通过体内外实验方法，考察微针辅助条件下微乳对葛根素经皮吸收效率的影响。
1 仪器与材料 1.1 仪器设备Agilent 1260 infinity高效液相色谱仪，美国安捷伦公司；Nano ZS 90激光粒度仪，英国Malvern公司；Minispin高速离心机，德国Eppendorf公司；GENIUS 3涡旋混合器，德国IKA公司；BAS224S型微量电子分析天平，德国Startotius公司；改良立式Franz扩散池，自制；WZ-50C6型微量注射泵，浙江史密斯医疗仪器有限公司；JA31002电子天平，上海精天电子仪器有限公司；金属微针，硅微针列阵，长度为300 μm，由上海应用技术大学李以贵教授课题组惠赠。
1.2 药品与试剂葛根素提取物，批号T19M7F11461，质量分数98%，上海源叶生物科技有限公司；葛根素对照品，供定量测定使用，批号110752-200410，质量分数99%，中国食品药品检定研究院；油酸聚乙醇甘油酯（Labrafilm 1944 CS）、聚乙二醇硬脂酸酯（Solutol HS-15）、二乙二醇单乙基醚（Transtol P），法国佳法赛公司；甲醇，色谱纯，德国Merck公司；水为双蒸水，自制。
1.3 实验动物清洁级雄性SD大鼠，体质量为（200±10）g，由上海中医药大学动物实验中心提供，合格证号SCXK（沪）2013-0016。
2 方法与结果 2.1 葛根素微乳的制备按照文献报道制备葛根素微乳[22]，按质量比称取下列各组分，油相：Labrafilm 1944 CS，5.51%；表面活性剂：Solutol HS-15，28.70%；助表面活性剂：Transtol P，14.30%；水相：双蒸水，49.45%；葛根素投药量为2.00%。实验1次制备的产品为10 mL，经激光粒度仪测定载药葛根素微乳平均粒径为（86.5±3.3）nm，多分散系数（PDI）为0.233±0.18（n=3），Zeta电位为（0.21±0.06）mV（n=3）。
2.2 微针辅助给药操作方法在使用葛根素微乳之前，预先用微针对动物的皮肤进行处理。将SD大鼠用水合氯醛（400 mg/kg）麻醉，小心剔除腹部的体毛。在体动物实验中，用金属微针在5 N的压力下垂直刺入皮肤，持续2 min后移除；离体动物实验中，先剥离皮肤，去除皮下脂肪，再用微针处理皮肤。
2.3 体外透皮实验 2.3.1 葛根素体外定量测定HPLC方法（1）色谱条件：色谱柱为Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；检测器为Agilent 1260紫外检测器；流动相为甲醇-水（30:70）；柱温为30 ℃；检测波长为250 nm；体积流量为1.0 mL/min；进样量为20 μL[23]。理论塔板数按葛根素峰计算不少于2850。
（2）对照品溶液的制备：精密称取一定量的葛根素对照品置10 mL量瓶中，加甲醇定容，得质量浓度约为100 μg/mL的葛根素对照品贮备溶液。精密量取不同体积的葛根素对照品贮备溶液，用空白透皮接收液（乙醇和生理盐水混合溶液，30:70）稀释，得质量浓度分别为0.5、1.0、2.0、3.0、4.5、10.0 μg/mL的葛根素对照品工作溶液。
（3）专属性：对比葛根素对照品溶液、空白透皮接收液和葛根素微乳透皮接收液样品的典型HPLC图谱，见图 1，考察分析方法的专属性。由图 1可见，空白接收液对葛根素的色谱峰没有干扰，该方法的专属性良好。
|
图 1 葛根素体外定量测定HPLC方法学考察典型图谱 Fig.1 Representative chromatograms for in vitro specificity validation of HPLC method for determination of puerarin |
（4）线性关系考察：将葛根素对照品工作溶液进行HPLC分析，以色谱峰峰面积积分值（Y）对葛根素的质量浓度（X）进行线性回归，所得回归方程为Y=498.7 X+937.4，r=0.999 9。葛根素在0.5~10.0 μg/mL体外透皮实验样品的色谱峰面积与葛根素质量浓度的线性关系良好。
2.3.2 微针辅助条件下葛根素微乳体外透皮实验采用改良Franz扩散池法（有效面积2.0 cm2，接收池体积12.5 mL），以葛根素微乳作为对照，对微针辅助条件下葛根素微乳的体外透皮行为进行考察。将预先用微针处理和未处理的大鼠离体皮肤固定在扩散池上，角质层朝向供给池、真皮层面向接收池。向接收池中注满接收液（乙醇和生理盐水混合溶液，30:70），向供给池中加入1.0 mL的葛根素微乳样品。实验期间用恒温循环水浴维持接收池的温度在（32±1）℃，并维持磁力搅拌（300 r/min）保证接收池内药物扩散迅速达到平衡。分别在2、4、6、8、12、24 h从接收池中取样0.5 mL，取样后均立即补加相同体积温度为32 ℃的空白接收液。样品溶液经0.45 μm微孔滤膜滤过，测定葛根素量。葛根素单位面积累积体外渗透量（Q，μg/cm2）按下面的公式计算。
|
Cn为第n个取样点测得的药物质量浓度（μg/mL），Ci为第i（i≤n-1）个取样点测得的药物质量浓度（μg/mL），V为扩散池体积（mL），Vi为第i次取样的体积（mL），A为有效透皮面积（cm2）
葛根素微乳和微针辅助条件下葛根素微乳组的Q-时间曲线见图 2。由图 2可见，微针辅助条件下葛根素微乳组和葛根素微乳组的24 hQ分别为137.36 μg/cm2和10.25 μg/cm2。与葛根素微乳相比，微针辅助条件下葛根素微乳可将葛根素在24 h内透过离体大鼠皮肤的Q提高12.4倍。
|
图 2 大鼠离体皮肤葛根素的Q-时间曲线(n=6) Fig.2 Cumulative in vitro skin permeation amount of puerarin versus time profiles (n=6) |
2.4 在体微透析实验 2.4.1 大鼠在体微透析接收液中葛根素HPLC定量测定方法
（1）色谱条件：测定方法同“2.3.1”项下色谱条件。
（2）标准样品溶液的制备：分别向200 μL的空白透析液中加入不同质量浓度的葛根素对照品工作溶液20 μL，涡旋1 min，得到葛根素质量浓度为50、100、150、300、450、1000 ng/mL的标准样品溶液，其中葛根素质量浓度为100、300、1000 ng/mL的标准样品溶液分别作为低、中、高质量浓度质控样品溶液。
（3）样品处理方法：透析液样品12000 r/min离心5 min，取上清，即得。
（4）专属性：对比空白皮肤透析液和葛根素微乳透析液样品的典型HPLC图谱，见图 3，考察方法的专属性。由图 3可见，空白接收液对葛根素的色谱峰没有干扰，方法的专属性良好。
|
图 3 大鼠在体微透析接收液中葛根素定量测定HPLC方法学考察典型图谱 Fig.3 Representative chromatograms for in vivo specificity validation of HPLC method for determination of puerarin in reception medium of rat skin microdialysis experiment |
（5）线性关系考察 将葛根素标准样品溶液进行HPLC分析，以色谱峰峰面积积分值（Y）对葛根素的质量浓度（X）进行线性回归，所得回归方程为Y=0.4725 X+0.9647，r=0.9996。葛根素在50~1000 ng/mL时，大鼠在体微透析接收液的色谱峰面积与葛根素质量浓度线性关系良好。
（6）探针回收率：按照文献中探针回收率的测定方法进行测定[24]，采用增量法测定低、中、高质量浓度质控样品的体外探针回收率分别为（33.48±1.78）%、（36.52±2.07）%、（36.81±2.43）%。采用减量法测定低、中、高质量浓度质控样品的体外探针回收率分别为（36.05±2.52）%、（38.93±1.14）%、（41.48±2.41）%；在体探针回收率分别为（30.05±1.78）%、（35.93±2.07）%、（37.48±2.43）%。体内外回收率较为一致，表明微透析实验方法可行。
（7）最低检测线、定量限：将葛根素微乳透析液样品稀释成一系列浓度梯度，进HPLC仪检测，测定样品峰峰高与噪音峰峰高的比值（信噪比）。方法的检测限（信噪比为3:1）为20 ng/mL；方法的定量限（信噪比为10:1）为45 ng/mL。
2.4.2 微针辅助条件下葛根素微乳大鼠在体微透析实验将SD大鼠随机分成葛根素微乳组和微针辅助条件下葛根素微乳组，每组6只。用水合氯醛（400 mg/kg）将大鼠麻醉，小心剔除腹部的毛发，将微透析探针用穿刺针引导平行植入预先用微针处理和未处理的大鼠皮下，在皮肤表面黏附给药池（2 cm2）、给予2.0 mL葛根素微乳，并在探针中通入灌流液（乙醇和生理盐水混合溶液，30:70）。预平衡30 min后开始计时，每1 h收集1份微透析接收液样品，直至10 h。测定微透析接收液中葛根素的质量浓度，并绘制大鼠在体微透析接收液中葛根素质量浓度-时间曲线，结果见图 4。结果表明，与葛根素微乳相比，微针辅助条件下葛根素微乳给药后大鼠在体微透析接收液中葛根素质量浓度明显提高。
|
图 4 葛根素微乳和微针辅助条件下葛根素微乳给药后大鼠在体微透析接收液中葛根素浓度-时间曲线(n=6) Fig.4 Puerarin level in rat skin microdialysis reception medium versus time profiles after application of puerarin microemulsion or microneedle-assisted puerarin microemulsion (n=6) |
采用Phoenix WinNonlin（Pharsight Corporation，Version 2.0）软件对葛根素微乳和微针辅助条件下葛根素微乳给药后大鼠在体微透析接收液中葛根素质量浓度-时间数据进行非房室模型拟合，计算药动学参数，结果见表 1。结果表明微针辅助条件下葛根素微乳组和葛根素微乳组的葛根素峰浓度（Cmax）分别为（713.51±72.23）、（108.56±5.72）ng/mL；微透析接收液中葛根素浓度-时间曲线下面积（AUC）分别为（5 021.45±547.09）ng·h/L和（622.36±41.21）ng·h/L。与微乳相比，微针辅助条件下微乳可将葛根素在大鼠在体微透析实验中Cmax和AUC分别提高5.57倍和7.07倍。
|
表 1 葛根素微乳和微针辅助条件下葛根素微乳的大鼠在体微透析实验药物动力学参数(x±s, n=6) Table 1 Pharmacokinetic parameters of puerarin microemulsion or microneedle-assisted puerarin microemulsion in rat skin microdialysis experiments in vivo (x±s, n=6) |
2.5 体内药动学研究 2.5.1 大鼠血浆样品中葛根素定量测定HPLC方法
（1）色谱条件：测定方法同“2.3.1”项下色谱条件。
（2）标准血浆样品溶液的制备：分别向100 μL的大鼠空白血浆中加入不同质量浓度的葛根素对照品工作溶液10 μL，涡旋1 min，得到葛根素质量浓度为50、100、150、300、450、1000 ng/mL的标准样品溶液，其中葛根素质量浓度为100、300、1000 ng/mL的标准样品溶液分别作为低、中和高质量浓度质控样品溶液。
（3）样品处理方法：向100 μL的血浆样品中加入甲醇400 μL，涡旋1 min，12000 r/min离心10 min，取上清，即得。
（4）专属性：对比空白大鼠血浆和葛根素微乳大鼠体内药动学研究血浆样品的典型HPLC图谱，见图 5，考察方法的专属性。由图 5可见，空白血浆对葛根素的色谱峰没有干扰，方法的专属性良好。
|
图 5 大鼠血浆中葛根素定量测定HPLC方法学考察典型图谱 Fig.5 Representative chromatograms for specificity validation of HPLC method for determination of puerarin in rat plasma |
（5）线性关系考察：将标准血浆样品溶液进行HPLC分析，以色谱峰面积积分值（Y）对葛根素质量浓度（X）进行线性回归，所得回归方程为Y=0.4725 X+0.9647，r=0.999 3。葛根素在50~1000 ng/mL时，大鼠血浆样品中葛根素色谱峰面积与其质量浓度线性关系良好。
（6）方法回收率试验：将葛根素血浆样品高、中、低浓度（每个样品平行6份），按血浆“样品处理方法”进行处理；同时配制相同质量浓度的葛根素对照品的甲醇溶液，进行HPLC分析，所得色谱峰面积与相对应的对照品色谱峰面积相比较。高、中、低质量浓度样品的回收率分别为（96.2±8.8）%、（85.1±15.9）%和（78.3±15.9）%，该血浆处理方法可行。
（7）最低检测线、定量限：将葛根素标准血浆样品稀释成一系列浓度梯度，进HPLC仪检测，测定样品峰峰高与噪音峰峰高的比值为（信噪比）。方法的检测限（信噪比为3:1）为25 ng/mL；方法的定量限（信噪比为10:1）为48 ng/mL。
2.5.2 微针辅助条件下葛根素微乳大鼠体内药动学研究将SD大鼠随机分成葛根素微乳组和微针辅助条件下葛根素微乳组，每组6只。实验前将大鼠禁食12 h，用水合氯醛（400 mg/kg）麻醉，小心剔除腹部的体毛，用医用胶带将无纺布固定在预先用微针处理或未处理的大鼠皮肤上，再加入2 mL葛根素微乳。分别在0、0.5、1、2、4、6、8、10、12、24 h收集大鼠血浆样品，300 μL/次，测定葛根素质量浓度。葛根素微乳经皮给药后，大鼠血浆中葛根素质量浓度未检出；微针辅助条件下葛根素微乳经皮给药后大鼠血浆中葛根素质量浓度-时间曲线见图 6。
|
图 6 微针辅助条件下葛根素微乳单次给药后大鼠血浆中葛根素质量浓度-时间曲线(n=6) Fig.6 Meam rat plasma concentration versus time profile of puerarin after single time transdermal application of microneedle-assisted puerarin microemulsion (n=6) |
采用Phoenix WinNonlin（Pharsight Corporation，Version 2.0）软件对微针辅助条件下葛根素微乳单次给药后大鼠血浆中葛根素质量浓度-时间数据进行非房室模型拟合，得到其主要药动学参数：Cmax为（234.35±25.02）ng/mL；tmax为（5.33±0.94）h；MRT为（10.84±0.06）h；AUC为（3047.13±486.51）ng·h/L。
3 讨论促进药物经皮吸收的方法大致可以分为被动法和主动法2类[25]，被动促进药物经皮吸收法（passive penetration enhancement techniques）通过提高药物向角质层中的扩散系数和分配系数等手段促进其经皮吸收，例如添加渗透促进剂，制备微乳均属于被动促进药物经皮吸收的范畴，但由于人体皮肤具有亲脂性角质层和亲水性活性表皮层双重屏障，被动吸收的程度也很有限；主动促进药物经皮吸收法（active penetration enhancement techniques）逐渐引起人们的关注。主动促进药物吸收法是指通过降低角质层的屏障作用促进药物经皮吸收，或者将药物主动导入皮肤的方法。采用机械或电学方法，在角质层上形成可逆的孔道可明显降低角质层的屏障作用，促进药物吸收，微针[12, 14]、电致孔[26-27]和超声波致孔[28]均属于主动促进药物经皮吸收的范畴。利用微针在皮肤上形成可供药物透过的可逆的孔道是一种典型的主动促进药物经皮吸收方法。将被动促进药物经皮吸收的方法与微针联合使用可以明显改善药物经皮吸收的效果。例如，环丙甲羟二氢吗啡酮是一种非常具有应用前景的镇痛药阿片受体拮抗剂，临床有口服和肌内注射2种给药形式，但其生物利用度低，用药量大。Milewski等[29]将环丙甲羟二氢吗啡酮聚乙二醇化形成前体药物、增加其溶解度，再通过微针致孔促进其经皮吸收。体外实验结果表明微针致孔可将环丙甲羟二氢吗啡酮透过离体皮肤的累积量提高5倍。
本研究的结果证实将被动和主动促进药物经皮吸收的方法相结合，例如，采用微针辅助条件下微乳的方法，可以显著提高难溶性药物的经皮吸收效率，但其促透机制仍有待于进一步研究。文献报道这是由于微针的作用，可以使表皮层产生大量微孔道[14, 30]，但目前尚不能确定葛根素微乳在微针辅助条件下是以完整的纳米粒经形成的孔道进入皮肤，还是葛根素从微乳中扩散出来再通过微针在皮肤中形成的孔道中经皮吸收，或者是二者兼而有之。微针辅助条件下促进葛根素微乳经皮吸收的机制还需要通过进一步的实验来考察。
| [1] | Song X P, Chen P P, Chai X S. Effects of puerarin on blood pressure and plasma renin activity in spontaneously hypertensive rats[J]. Acta Pharmacol Sin, 1988, 9(1): 55–58. |
| [2] | 陈光芝, 刘艳华. 中药葛根的研究进展[J]. 中华临床医药卫生杂志, 2004, 2(1):48–50. |
| [3] | 赵艳威, 李宗旻, 宋光明, 等. 葛根素促进人成骨样MG-63细胞分化的分子机制研究[J]. 中草药, 2014, 45(4):536–540. |
| [4] | 王守力, 韩雅玲, 于海波, 等. 常氧与缺氧状态下豚鼠心肌细胞内钙离子浓度与葛根素注射液的干预[J]. 中国临床康复, 2005, 9(19):142–144. |
| [5] | 高尔, 谭爱美, 刘振威, 等. 乳化葛根素对家兔血液流变性和微循环的作用[J]. 中国微循环, 2004, 8(5):291–292. |
| [6] | 刘伟星, 李宁, 高崇凯. 葛根素自微乳化渗透泵控释胶囊的制备[J]. 中草药, 2013, 44(12):1568–1573. |
| [7] | 马家骅, 杨明, 曹世栋, 等. 葛根素的提取和含量测定[J]. 华西药学杂志, 2006, 21(2):206–207. |
| [8] | 中国药典[S].二部.2015. |
| [9] | 王立, 张君, 王文倩. 葛根素泡腾性渗透泵控释片的制备及其体外评价[J]. 中草药, 2013, 44(6):686–691. |
| [10] | 林思.醇质体/丝素蛋白复合纳米纤维膜经皮给药系统的构建及其评价研究[D].上海:东华大学, 2016. |
| [11] | 白毅, 杜丽娜, 冯雪, 等. 天然药物经皮给药系统研究进展[J]. 中国药学杂志, 2014, 49(16):1377–1381. |
| [12] | Zhang W, Ding B Y, Tang R J, et al. Combination of microneedles with PLGA nanoparticles as a potential strategy for topical drug delivery[J]. Current Nanoscience, 2011, 7(4): 545–551. DOI:10.2174/157341311796196727 |
| [13] | Alvarez-Román R, Naik A, Kalia Y N, et al. Skin penetration and distribution of polymeric nanoparticles[J]. J Control Release, 2004, 99(1): 53–62. DOI:10.1016/j.jconrel.2004.06.015 |
| [14] | 甄小龙, 刘婷, 杨文婧, 等. 青藤碱水凝胶贴剂的微针经皮给药的研究[J]. 中草药, 2010, 41(6):892–896. |
| [15] | Gomaa Y A, El-khordagui L K, Garland M J, et al. Effect of microneedles treatment on the skin permeation of a nanoencapsulated dye[J]. J Pharm Pharmacol, 2012, 64(11): 1592–1602. DOI:10.1111/jphp.2012.64.issue-11 |
| [16] | Zhang H, Cui Y, Zhu S, et al. Characterization and antimicrobial activity of a pharmaceutical microemulsion[J]. Int J Pharm, 2010, 395(1/2): 154–160. |
| [17] | 卢秀霞, 潘婷婷, 洪于琦, 等. 茶树油微乳凝胶的制备及其质量评价[J]. 中草药, 2015, 46(13):1892–1900. |
| [18] | Goebel A S B, Knie U, Abels C, et al. Dermal targeting using colloidal carrier systems with linoleic acid[J]. Eur J Pharm Biopharm, 2010, 75(2): 162–172. DOI:10.1016/j.ejpb.2010.02.001 |
| [19] | Tenjarla S. Microemulsions:an overview and pharmaceutical applications[J]. Crit Rev Ther Drag Carrier Syst, 1999, 16(5): 461–521. |
| [20] | 杨志欣, 张文君, 刘明玉, 等. 三叶豆紫檀苷磷脂复合物自微乳研制及跨膜转运研究[J]. 中草药, 2016, 47(4):573–579. |
| [21] | Santoyo S, Arellano A, Ygartua P, et al. In vitro percutaneous absorption of piroxicam through synthetic membranes and abdominal rat skin[J]. Pharm Acta Helv, 1996, 71(2): 141–146. DOI:10.1016/0031-6865(96)00004-0 |
| [22] | 郭建民, 李素梅. 高效液相色谱法测定复方葛根透皮贴剂中葛根素的含量[J]. 黑龙江医药, 2011, 24(1):1–2. |
| [23] | 蒋楠, 孙雯, 李哗, 等. 葛根素微乳的制备及体外透皮特性研究[J]. 西北药学杂志, 2013, 28(2):180–182. |
| [24] | 王丹, 石力夫, 胡晋红. 微透析联用反相高效液相色谱对大鼠皮肤葛根素的药代动力学研究[J]. 分析化学, 2008, 28(10):2306–2312. |
| [25] | Alexander A, Dwivedi S, Ajazuddin, et al. Approaches for breaking the barriers of drug permeation through transdermal drug delivery[J]. J Control Release, 2012, 164(1): 26–40. DOI:10.1016/j.jconrel.2012.09.017 |
| [26] | Denet A R, Vanbever R, Préat V. Skin electroporation for transdermal and topical delivery[J]. Adv Drug Deliv Rev, 2004, 56(5): 659–674. DOI:10.1016/j.addr.2003.10.027 |
| [27] | 郝保华, 王彦玲, 李伟泽, 等. 青风藤电离巴布剂电致孔透皮给药的药动学研究[J]. 中草药, 2009, 40(7):1060–1062. |
| [28] | Azaguri R, Khoury L R, Enden G, et al. Ultrasound mediated transdermal drug delivery[J]. Adv Drug Deliv Rev, 2014, 72(1): 127–143. |
| [29] | Milewski M, Yerramreddy T R, Ghosh P, et al. In vitro permeation of a pegylated naltrexone prodrug across microneedle-treated skin[J]. J Control Release, 2010, 146(1): 37–44. DOI:10.1016/j.jconrel.2010.05.034 |
| [30] | Zhang W, Ding B Y, Tang R J, et al. Combination of microneedles with PLGA nanoparticles as a potential strategy for topical drug delivery[J]. Current Nanoscience, 2011, 7(4): 545–551. DOI:10.2174/157341311796196727 |