和厚朴酚（honokiol）来自于中药厚朴，是其最主要的两个活性成分之一。和厚朴酚具有多种生物学活性，如抗菌、抗炎、中枢性肌肉松弛和神经抑制作用、抗血小板凝聚、降低胆固醇、抗肿瘤等^[1]，还具有明显的抗肿瘤作用^[2-4]。但是其结构中含酚羟基，稳定性较差，易被氧化。又因其水溶性差，限制了和厚朴酚的开发、应用。前期对和厚朴酚的体内外抗肿瘤作用进行了研究，发现和厚朴酚在体内具有抗肝癌效果^[5]，顾伟等^[6]在和厚朴酚对肝癌HepG2细胞生长抑制及凋亡的作用一文也明确肯定了和厚朴酚对肝癌的抑制效果。本文将继续对和厚朴酚针对其他类型肿瘤体内及体外的抗肿瘤作用进行研究。

脂质体系指将药物包封于类脂质双分子层内而形成的超微型球状载体制剂，其结构为一层或多层同心脂质双分子层，亦称类脂小球或液晶微囊。脂质体材料与生物体细胞膜成分相似，具有良好的生物相容性和生物可降解性。此外，脂质体还具有肿瘤靶向和缓释作用^[1]。在已报道的各实验研究中对脂质体的制备方法多采用薄膜-超声分散法制备，而本实验采用注入法制备和厚朴酚脂质体，操作简便易行，且药载比、包封率优于许多文献报道。

Meppler Toledo AL204型电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；PURELAB Classic综合纯水仪（英国ELGA公司）；KQ3200DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；RE-52CS型旋转蒸发器（上海振捷实验设备有限公司）；HW·SY11-K2电热恒温水浴锅（北京市长风仪器仪表有限公司）；Zetasizer-nanozs 90 纳米粒度及Zeta电位分析仪（马尔文仪器有限公司）；Ultimate 3000 Series高效液相色谱仪（戴安中国有限公司）；Maisch Symmetry C₁₈色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；MCA-15AC细胞培养箱（日本Sanyo公司）；Tecan M1000多功能连续波长酶标仪（瑞士）；0.22 μm超速离心管（美国Millipore公司）。

和厚朴酚（上海士峰生物科技有限公司，质量分数98.0%，批号35354-74-6），mPEG2000- DSPE2000（上海拓旸生物科技有限公司）；卵磷脂（广州白云山汉方现代药业有限公司，批号A4150920）；4T1细胞（北京协和医学院基础所细胞中心）；RPMI 1640培养基、胎牛血清、青霉素和链霉素双抗（美国Gibco公司）；96孔无菌培养板（美国Corning公司）；3-（4,5-二甲基噻唑2）2,5-二苯基四氮唑溴盐（噻唑蓝，MTT，美国Sigma公司）；乙腈（色谱纯，HiPure Chem公司），乙醇、二甲基亚砜（DMSO）等其他药品及试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

将和厚朴酚、mPEG2000-DSPE2000、胆固醇、卵磷脂按照1:1:1:3（质量比）溶于1 mL乙醇中，超声（25 ℃、250 W）条件下匀速缓慢注入到5 mL去离子水中，45℃减压旋转蒸发除去乙醇后得到和厚朴酚脂质体。以Zetasizer nano ZS型粒度仪测定和厚朴酚脂质体的粒径、粒度分布和表面电位。

将蛋黄卵磷脂、胆固醇、mPEG2000-PCL2000、和厚朴酚按照质量比3:1:1:1成功以乙醇注入法制备了和厚朴酚脂质体，其平均粒径为（113.8±0.2）nm，PDI值为（0.209±0.005）（图 1），Zeta电位为（-30.7±2.4）mV。

图 1 和厚朴酚脂质体的粒径分布图 Fig. 1 Particle size and distribution of HK-Liposomes

精密移取0.5 mL脂质体置于超滤离心管中 5 000 r/min离心1 h。HPLC测定滤液中和厚朴酚含量，计算未包封的和厚朴酚量（M₁）。色谱条件：Symmetry C₁₈（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.2%甲酸水（75:25），体积流量1.0 mL/min，紫外检测波长294 nm，柱温25℃，进样量20 μL。另外精密移取0.5 mL脂质体，用乙腈稀释5倍后测定和厚朴酚浓度，计算这0.5 mL脂质体中和厚朴酚总量（M₂），计算包封率（EE），计算公式为 EE=（M₂－M₁）/M₂。

以HPLC法在294 nm处对和厚朴酚进行含量测定，其标准曲线方程为A = 0.792 48 C-0.309 07（R²=0.999 8），线性范围0.1～200 μg/mL。通过对和厚朴酚脂质体内游离和厚朴酚以及总和厚朴酚的量进行测定，计算得到脂质体包封率为94%，证明和厚朴酚脂质体的制备比较成功。

以和厚朴酚含量计，将制备的和厚朴酚脂质体稀释到0.1 mg/mL，分别取5 μL样品滴在300目的铜网上，5 min后吸去多余的脂质体，晾置于阴凉处10 min后，再用5 μL 0.5%的醋酸铀染色1.5 min，自然晾干3 h后，透射电镜下观察并拍照，加速电压80 kV。

在透射电镜下观察和厚朴酚脂质体类球形，分布较为均匀，平均粒径为50 nm左右（图 2）。

图 2 和厚朴酚脂质体透射电镜照片 Fig. 2 Transmission electron microscope images of HK Liposomes

精密吸取1 mL和厚朴酚脂质体逐渐滴加到等体积的2×PBS缓冲液、1.8% NaCl溶液、10%葡萄糖溶液、人工胃液、人工肠液中，37 ℃孵育，考察其在各介质中不同时间点的粒径变化。另将和厚朴酚脂质体放置于室温下储存，在不同时间点测其粒径，考察其室温放置稳定性。以上各实验平行进行3份。由表 1中可见和厚朴酚脂质体在PBS缓冲液、0.9% NaCl溶液、5%葡萄糖溶液、人工胃液、人工肠液中均能够稳定存在，7 h后在各介质中和厚朴酚脂质体平均粒径均在90～119 nm，比较稳定。

表 1(Table 1)

表 1 HK脂质体在不同分散介质中的稳定性考察（x±s，n=3） Table 1 The stability of HK Liposomes in different dispersed medium (x±s,n=3) 介质 粒径/nm 0 h 1 h 3 h 5 h 7 h 人工胃液 117.9±2.05 117.4±3.014 114.0±1.779 119.1±2.328 114.1±2.234 人工肠液 107.3±1.249 107.2±2.307 104.4±2.031 108.3±2.316 102.3±1.274 PBS 107.0±1.054 106.9±1.179 105.0±1.778 101.9±1.328 98.38±1.960 0.9%NaCl 108.8±3.675 97.64±2.731 95.78±1.155 95.00±2.228 90.32±2.171 5%葡萄糖 114.9±1.457 119.5±1.888 115.7±3.027 115.3±1.361 108.8±3.675

表 1 HK脂质体在不同分散介质中的稳定性考察（x±s，n=3） Table 1 The stability of HK Liposomes in different dispersed medium (x±s,n=3)

配制含10%胎牛血清、100 U/mL的青、链霉素的1640培养液。于37 ℃、5% CO₂细胞培养箱中培养 4T1细胞，每2天更换1次培养液并用胰酶消化传代。将生长到对数期且细胞密度达到80%～90%的4T1细胞用所配制的1640培养液配成单个细胞悬液，以1×10⁴个细胞每孔接种于96孔板中，继续用5% CO₂、37 ℃培养细胞。24 h后吸去培养液，加上200 μL含药不含胎牛血清的培养基继续培养，24 h后按照0（对照组）、0.5、2.5、5、15、25、50、80 μg/mL的质量浓度给药，每个质量浓度6个复孔，孵育24 h后每孔加入20 μL用PBS配制的5 mg/mL的MTT溶液，继续孵育4 h，终止培养，吸去各孔内液体，每孔加DMSO溶液200 μL，充分震荡，使蓝紫色沉淀溶解后，用酶标仪测定570 nm波长处的吸光度（A₅₇₀）值。不同质量浓度和厚朴酚脂质体溶液对乳腺癌细胞的增殖抑制率=（对照组A₅₇₀-用药组A₅₇₀）/对照组A₅₇₀。

不同给药浓度下和厚朴酚脂质体和游离药物对4T1细胞的抑制情况见图 3。可以看出相同剂量下和厚朴酚脂质体组比和厚朴酚溶液组对细胞的杀伤效果更为明显；孵育24 h后脂质体和游离药物对4T1细胞的IC₅₀值分别为43.74、12.52 μg/mL，两组IC₅₀值具有显著性差异（P＜0.01），证明将和厚朴酚制备成脂质体有利于提高其药效。

与DMSO组比较：**P＜0.01 **P＜0.01 vs DMSO group 图 3 和厚朴酚脂质体作用48 h后对HepG2细胞株增殖抑制曲线（，n=3） Fig. 3 Proliferation inhibition of HK liposomes against 4T1 cells after 24 h of incubation (,n=3)

将体外培养至对数期的4T1细胞用PBS配成细胞密度为1×10⁷个/mL的细胞悬液，取0.2 mL接种于雌性小鼠腋下，7 d后用游标卡尺量肿瘤大小，当肿瘤长大约300 mm³时筛选出瘤体积相对一致的60只荷瘤小鼠进行实验。

将60只荷瘤小鼠随机分为6组，分别为和厚朴酚脂质体高（60 mg/kg）、中（40 mg/kg）、低（20 mg/kg）3个剂量的实验组（均ip给药），以及紫杉醇（PTX）注射剂组（4 mg/kg，ip）、和厚朴酚悬浮液组（60 mg/kg，ig）、生理盐水对照组。以上6组实验动物按照给药剂量隔天给药1次。连续给药9次。

实验中观察小鼠的一般生理情况及移植瘤体积生长情况。每次给药前称量小鼠体质量并记录，对比治疗前后体质量变化。同时以游标卡尺测量皮下移植瘤最长径a和垂直的短径b，根据公式肿瘤体积(V) = ab²/2计算肿瘤体积，绘制每组动物平均肿瘤瘤体积随时间变化的曲线图。最后一次给药24 h后脱颈处死动物，剥离肿瘤并称瘤质量（W），按照下面的共识计算肿瘤抑瘤率。

肿瘤抑瘤率=（1-W_实验组/W_{生理盐水对照组}）

（1）给药后小鼠体质量变化曲线 4T1荷瘤小鼠在给药期间的体质量变化见图 4，可以看出，对照组小鼠的体质量始终呈增长的趋势。统计学分析显示，和厚朴酚脂质体中、高剂量组与生理盐水组相比具有显著性差异（P＜0.05），其他组别未见显著性差异。说明给定剂量下中、高剂量组对小鼠生长具有一定毒副作用。而和厚朴酚脂质体低剂量组、紫杉醇注射液组、和厚朴酚悬浮液组对小鼠生长未见明显毒性。

与生理盐水组比较：*P＜0.05 *P＜0.05 vs saline group 图 4 给药后各组小鼠的体质量变化（n=10） Fig. 4 The body weight change of mice after ip administration of HK-Liposomes,PTX injection,negative control and ig administration of HK-Suspension (n = 10)

（2）给药后小鼠肿瘤体积变化曲线试验过程中肿瘤体积变化趋势见图 5。肿瘤增长速度由慢到快依次为脂质体高剂量组、中剂量组、灌胃高剂量组、紫杉醇阳性药组、脂质体低剂量组、生理盐水组。再将各组与生理盐水组对比，分别做统计学差异均显示出具有显著性差异（P＜0.001），说明各给药组均对肿瘤生长起到抑制作用。将各组对脂质体高剂量组做统计学考察，各组与脂质体高剂量组均具有统计学差异（P＜0.001），说明HK脂质体的药效优于其他各组及阳性药组。显示HK脂质体具有潜在研究开发的临床价值。

与生理盐水组比较：*P＜0.001；与和厚朴酚脂质体高剂量组比较：#P＜0.001 *P＜0.001 vs saline group; #P＜0.001 vs HK-Liposomes 60 mg/kg group 图 5 和厚朴酚脂质体、混悬剂和PTX阳性药对4T1荷瘤小鼠的抑瘤率（n=10） Fig. 5 The in vivo antitumor effects of HK-Liposomes in 4T1 tumor-bearing mice (n=10)

（3）和厚朴酚脂质体对小鼠肿瘤生长抑制率最后一次给药后24 h解剖小鼠后得到实体瘤并称量肿瘤质量。以生理盐水组的小鼠肿瘤质量为对照，各实验组肿瘤抑制率见表 2。解剖后得出数据与活体测量瘤体积的数据基本一致，各给药组相对于生理盐水组显著抑制肿瘤生长。脂质体中、高剂量组抑瘤率明显高于阳性药组。和厚朴酚脂质体中剂量组的肿瘤抑制率高于高剂量的和厚朴酚原料药组，说明脂质体可有效提高和厚朴酚药物的抗肿瘤效果，为和厚朴酚抗肿瘤应用的合适剂型。

表 2(Table 2)

表 2 HK-Nps对4T1小鼠的抑瘤率（n=10） Table 2 The in vivo antitumor effects of HK-Liposomes in 4T1 tumor-bearing mice (n=10) 组别 剂量/(mg∙kg-1) 肿瘤质量/g 抑制率/% 生理盐水 — 1.840 0±0.170 5# — PTX 5 0.816 7±0.207 9*# 55.62 和厚朴酚原料 60 0.990 0±0.143 3*# 46.20 和厚朴酚脂质体 20 1.144 0±0.207 9*# 37.83 40 0.718 6±0.123 6*# 60.95 60 0.272 5±0.061 3* 85.19 与生理盐水组比较：*P＜0.001；与和厚朴酚脂质体高剂量组比较：#P＜0.001 *P＜0.001 vs saline group; #P＜0.001 vs HK-Liposomes 60 mg/kg group

表 2 HK-Nps对4T1小鼠的抑瘤率（n=10） Table 2 The in vivo antitumor effects of HK-Liposomes in 4T1 tumor-bearing mice (n=10)

本研究采用乙醇注入法成功制备了小粒径的和厚朴酚脂质体。平均粒径是衡量脂质体制备成功与否的重要参数，平均粒径越小，越有利于脂质体在机体内的被动靶向作用，较大的电位绝对值有利于其在水中通过静电斥力而稳定存在。吴德强^[7]在和厚朴酚脂质体的制备及表征一文中，制备的脂质体粒径为150 nm。张卿^[8]在和厚朴酚固体脂质纳米粒的制备及性质研究一文中，记录制备得到的脂质体平均粒径为159 nm。而本文所制备的脂质体平均粒径为113.8 nm，较小的粒径更利于脂质体在体内的被动靶向作用，有助于提高其作为抗癌药物的药效。初步结果显示所制备的脂质体室温放置稳定性良好，具有继续研究的意义。透射电镜下观察到脂质体粒径较马尔文粒径仪测得的粒径小，这是由于TEM中测的为脂质体粒子在干态情况下的粒径，而激光粒度仪测得的粒径为水化粒径。所以TEM中观察到的和厚朴酚脂质体的粒径大小小于马尔文粒径仪中测到的粒径值。和厚朴酚脂质体在人工胃肠液、等渗溶液及缓冲盐中粒径变化较小，显示所制备的和厚朴酚脂质体既能口服给药，也可注射给药，可用于多种给药方式及剂型的制备。

现有关于和厚朴酚的研究较多，但对于和厚朴酚抑制乳腺癌细胞的体内增殖作用的文章较少。张宇等^[9]在和厚朴酚脂质体联合阿霉素抑制4T1细胞增殖的机制研究一文是为数不多的有关和厚朴酚有关乳腺癌细胞的研究，但其仅限于体外研究，而且主要为联合用药，逆转多药耐药性。本文则主要研究和厚朴酚单独给药对于乳腺癌细胞的体内外生长、增殖的影响。无论是本试验中单独对于乳腺癌细胞还是其他文献中对于胶质瘤^[11]、口腔鳞癌^[12]、结肠癌^[13]细胞其抑瘤效果已经得到证实，但针对以上几种细胞均未尝试脂质体载药，后续研究中将继续探讨脂质体对以上肿瘤细胞的抑制作用，顺便筛选对和厚朴酚更为敏感的细胞株。